Continuous Microfluidic Process for Electroporation and Extraction of Microalgal Cells

Abstract

본 논문은 미세조류의 전기천공과 추출을 위한 연속 미세유체공정의 개발에 관한 연구이다. 본 연구에서는 미세조류의 바이오매스와 바이오리파이너리 경제성 확보를 위해 업스트림(upstream)과 다운스트림(downstream) 관점에서 공정 개선을 위한 미세유체시스템을 개발하였다. 제 1장에서는 미세유체 기반의 미세조류 연구에 대해서 전반적으로 다루었으며, 미세조류의 바이오매스 및 바이오리파이너리 공정을 업스트림과 다운스트림으로 분류하여 경제성확보를 위해 개발된 다양한 미세유체 시스템에 대해서 설명하였다. 또한 기존 보고된 연구 결과를 기반으로 본 학위 논문에서 다루고자 하는 연구의 전반적인 개요를 제시 하였다. 제 2 장에서는 업스트림관점에서 우량 균주 제작을 위한 새로운 도구의 필요성을 인지하고 미세유체기반의 형질전환 장치를 개발하였다. 동물세포와 달리 두꺼운 세포벽으로 형질전환 효율이 낮은 미세조류는 외래유전자의 저항성이 높아 유전 또는 대사 공학적 균주의 개량에 한계가 있다. 이와 같은 한계점을 극복하고자 전극 사이의 간격을 줄이고, 세포가 직접적으로 전극면과 닿지 않게 함으로써 세포 생존율이 높은 폴리이마이드 필름 기반의 전기 천공 장치를 개발하였다. 결과적으로 상용화 제품과 비교하여 약 50배 긴 지속시간에서 우수한 세포 생존율과 개선된 전달 효율을 검증하였다. 또한 ptCrCFP 외래 유전자를 주입하여 형질전환체의 제작을 형광단백질 발현과 PCR로 검증함으로써 실제 미세조류의 유전공학 장치로서의 응용 가능성을 확인하였다. 게다가 장시간 장치 사용에 따른 전극면 손상도와 전달 효율을 측정하여 3시간 동안 장치를 사용하였을 때 얻을 수 있는 콜로니의 수를 이론적으로 계산함으로써 형질전환의 한계를 확률적으로 개선 할 수 있는 연속미세유체 장치의 활용 가능성을 제시하였다. 제 3장에서는 미세조류 바이오매스와 바이오리파이너리 다운스트림 공정에서 갖는 에너지 대비 낮은 추출 효율 개선을 위한 연속흐름방식의 세포의 분리 미세유체장치를 개발하였다. 항산화 물질로 잘 알려진 아스타잔틴은 의학, 기능성식품, 사료, 화장품 등 응용 가치가 높아 전세계적으로 시장이 커지고 있는 추세이다. 특히, 자연유래 아스타잔틴은 합성 아스타잔틴 대비 안정성과 항산화활성도가 우수하기 때문에 관심도가 높아지고 있다. 그러나 합성 아스타잔틴 대비 낮은 경제성은 자연유래 아스타잔틴 시장의 한계이므로 생산성 증대 또는 추출 효율 증대와 같은 다양한 접근법을 통해 극복해야 할 문제이다. 본 연구에서는 세포 크기별 분리 공정 개발을 통해 아스타잔틴 함유량이 가장 높다고 알려진 Haematococcus.pluvialis의 추출률을 개선하고자 한다. 나선형 미세유체 채널 내부의 유동과 이차관성으로 발생하는 Dean 유동은 크기에 따라 세포가 받는 전체 힘이 달라 측면 이동을 유도한다. 결과적으로 출구의 위치에 따라 세포의 크기가 다르게 분리됨을 검증하였으며, 추가적으로 분리된 세포들은 유체역학 유동에 의해 발생하는 전단응력에 의해 아스타잔틴이 쉽게 추출됨을 검증하였다. 특히, 지용성 물질인 아스타잔틴은 구조적 특성으로 물상에 노출 되었을 때 액적을 형성하며 다른 물질과 혼합되지 않기 때문에 정제 공정에 소모되는 비용을 절감할 수 있는 장점이 있다. 미세유체 기반의 미세조류 추출 연속 공정 시스템은 큰 세포만을 선별하여 추출 효율을 증진시키고 작은 세포는 추가 배양 공정을 통해 추가 아스타잔틴 축적 후 추출하는 공정으로 응용이 가능하며 배양에 소모되는 시간을 감소함으로써 전반적인 다운스트림 공정을 개선 할 수 있는 혁신적인 제안이 될 것으로 기대한다. 제 4장에서는 본 학위 논문에서 수행한 연구에 대해서 요약하고 개발된 장치의 응용 가능성과 향후 전망에 대해서 제시하였다.

In this thesis, a novel continuous microfluidic platform capable of precise control of hydrodynamic flow was developed and applied to upstream and downstream of the biomass and biorefinery in two distinct studies. Chapter 1 covers the study of microalgae based on microfluids, and describes various microfluidic systems developed to improve the process by classifying the biomass and biorefinery processes of microalgae into upstream and downstream. Also, based on the previously reported research results, an overall overview of the research in this dissertation was presented. In Chapter 2, we recognized the need for a new tool for producing a superior strain from an upstream perspective and developed a microfluidic transformation device. Unlike animal cells, microalgae that have low transformation efficiency due to thick cell walls and high resistance to foreign genes. Thus have limitations in improving genetic or metabolic engineering strains. In order to overcome such limitations, an electroporation device with high cell viability based on a polyimide film was developed by reducing the gap between electrodes and preventing the cells from directly contacting the electrode surface. As a result, excellent cell viability and improved delivery efficiency were verified at a duration approximately 50 times longer than that of commercial products. In addition, the production of transformants by ptCrCFP foreign genes was verified by fluorescence protein expression and PCR to confirm the applicability of actual microalgae as a genetic engineering device. The result of damage on surface of electrodes demonstrated that possibility of reuseable device. In Chapter 3, we developed a microfluidic device for separating cells in a continuous flow method to improve the extraction efficiency with low consume energy in the microalgae biomass and biorefinery downstream processes. Astaxanthin, well known as an antioxidant, has high application value in medicine, functional food, feed and cosmetics, and the market is growing worldwide. In particular, natural astaxanthin is of increasing interest due to its superior stability and antioxidant activity compared to synthetic astaxanthin. However, lower economic efficiency than synthetic astaxanthin is a limitation of the naturally derived astaxanthin market, which is a problem that must be addressed through various approaches such as increased productivity or increased extraction efficiency. In this study, we aim to improve the extraction rate of Haematococcus.pluvialis, which is known to have the highest astaxanthin content, through the development of a separation process by cell size. The flow inside the micro channel and the secondary inertial Dean flow generated by spiral channel induces lateral movement due to the different total force received by the cells depending on the size. As a result, cells was separated differently according to the location of the outlet, and additionally, the separated cells easily extracted astaxanthin by shear stress generated by hydrodynamic flow. The developed continuous process-based microfluidic system includes a sequential process strategy to improve overall downstream processes. The separated large cells flow directly to the extraction process, and the small cells can flow to the additional culture process as a supplementary step and then to the final extraction step. As such, the passive-based separation system is expected to be applicable to a large-scale system because of the high throughput compared to an active separation system based on optical analysis of a single cell. The innovative platform and results presented in this thesis provide new tool to overcome limitation of transformation in the challenging area of upstream, and provide insight that can improve downstream.