Role of CX3CR1+ mononuclear cells and TRAF6 in the regulation of hematopoietic stem and progenitor cells

Abstract

Hematopoiesis refers to the entire process of blood production involving the differentiation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs), which are precisely regulated by external demands or intrinsic genetic regulation for continued lineage generation. However, the factors involved in regulating steady-state hematopoiesis and their underlying mechanisms remain to be examined in detail. As an extrinsic regulator, recent studies have shown that gut microbiota promotes hematopoiesis in the steady-state. However, how intestinal microbiota plays a role in the regulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) is unclear. In the previous studies of my laboratory, it is suggested that microbiota-derived molecules are systemically circulating and are sensed by CX3CR1+ mononuclear cells (MNCs) in the bone marrow (BM). Based on these results, in the first part of this dissertation, I studied whether and how CX3CR1+ MNCs participate in the steady-state hematopoiesis. I demonstrated that CX3CR1+ MNCs interact with HSPCs at the perivascular region of the BM by using immunofluorescence staining. CX3CR1+ MNCs expressed niche molecules on their surface to maintain HSPCs around CX3CR1+ MNCs. Moreover, CX3CR1+ MNCs produced inflammatory cytokines in the steady-state to facilitate myelopoiesis. This seems to be mediated by MyD88- and UNC93B1-dependent signaling pathways, indicating that CX3CR1+ MNCs play a role in carrying microbiota-derived signals to HSPCs. These data suggest that interactions between HSPCs and CX3CR1+ MNCs maintain adult myelopoiesis under normal conditions. In the second part of this study, I found that tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) plays a role in hematopoiesis. I found that Vav1-cre; Traf6fl/fl mice lacking TRAF6 in HSCs undergo abnormal bone formation and premature death. Ablation of TRAF6 induced aggressive expansion of fetal HSPCs and attenuated postnatal hematopoiesis. However, TRAF6 was dispensable in adult hematopoiesis. These results suggest that TRAF6 participates in the hematopoietic process in a flexible manner during hematopoietic development. Overall, these findings suggest that hematopoiesis is tightly regulated by TRAF6 as an intrinsic regulator of fetal- and postnatal- hematopoiesis, and by CX3CR1+ MNCs as exogenous regulators that relay microbiota- derived signals during adult hematopoiesis.

조혈모세포는 모든 혈액세포를 생성할 수 있는 가장 상위 단계의 줄기세포로서 정상상태의 척추동물의 경우에서 대부분 골수에 상주한다. 조혈모세포는 골수 백혈구의 약 0.1 % 이하를 차지하고 있으며, 자기복제능과 다분화능을 가짐으로써 개체의 일생 동안 필요한 모든 혈액세포를 생성하는데, 이 과정을 조혈과정이라 한다. 조혈 과정은 조혈모 및 전구세포의 세포 내부의 유전적 요인 및 외부의 자극에 대한 반응으로 미엘로이드 또는 림포이드 계열의 혈액세포로 분화한다. 지금까지의 조혈모 및 전구세포 연구는 주로 특정 유전자 및 질병 상황에서의 기능 연구를 중심으로 이루어져 왔다. 그러나 이러한 질병 등에서의 기능 연구 이외에 정상상태에서 어떻게 조혈 과정이 유지되는지에 대해서는 여전히 논의될 부분이 많다. 최근 장내 미생물이 조혈모 및 전구세포의 항상성 조절에 관여하며, 미엘로이드 계통분화 유도에 중요한 요인으로 작용함이 보고되었다. 본 연구실의 기존 연구 결과에서, 장내 미생물은 골수 내 CX3CR1+ 단핵구세포를 통해 정상상태의 조혈과정을 유지할 가능성이 확인되었다. 이에 본 연구에서는 다양한 in vivo 및 ex vivo 실험을 통하여 골수 내 CX3CR1+ 단핵구세포의 조혈과정에 어떻게 관여하는가에 대한 새로운 기능에 대해 밝혀내었다. 이에 앞서, CX3CR1+ 단핵구세포가 단핵구 분화에 필요한 유전자 및 염증성사이토카인 생성과 식작용과 관련된 유전자를 높게 발현하고, 골수 내의 혈관 주위에 두루 분포함을 면역형광염색법으로 확인하였다. 골수 내에서 CX3CR1+ 단핵구세포만이 CD11c를 발현하고 있음에 착안하여, Cd11c.DOG 생쥐에 디프테리아 톡신 투여로 인한 CX3CR1+ 단핵구세포의 제거를 유도하였다. 이때 다분화능 전구세포와 미엘로이드 전구세포 및 계통분화 세포의 감소를 발견하였다. CX3CR1+ 단핵구세포가 다분화능 전구세포의 근거리에 위치하고 있음이 관찰되었는데, 근거리에서 다분화능 전구세포의 세포의 계통 분화를 매개함을 추측하게 하였으며, 그 요소로 보금자리 물질 CXCL12, VCAM1, ICAM1, SCF과 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6 를 높게 발현하고 있음을 확인하였다. 그러나 CXCL12의 CX3CR1+ 단핵구세포 특이적인 제거는 조혈모 및 전구세포의 변화를 찾기는 어려웠다. CX3CR1+ 단핵구세포 에서 엔도솜 Toll-like receptor (TLR) 을 통한 사이토카인 생성 및 분비가 일어나고 있음을 발견하였고, CX3CR1+ 단핵구세포 특이적으로 엔도솜 TLR 의 신호전달경로를 억제했을 경우 정상상태의 미엘로이드 계통분화가 억제됨을 확인할 수 있었다. 본 연구실의 사전 연구결과에서 장내미생물유래물질은 CX3CR1+ 단핵구세포 특이적으로 검출되었다. 이에 어떻게 CX3CR1+ 단핵구세포가 장내미생물유래물질을 인식하는지 알아보기 위하여 CX3CR1+ 단핵구세포가 혈액 내로 수상돌기를 뻗음으로써 CX3CR1+ 단핵구세포 특이적 외부 물질 검출이 가능하리라 가설을 세우고, 이를 검증하기 위하여 형광물질이 결합된 면역세포 특이적 항체 (anti-CD45-APC)를 Cx3cr1GFP/+생쥐에 주입하였다. 단시간동안의 면역세포 염색 유도는 CX3CR1+ 단핵구세포에서의 항체 반응이 가장 높음을 보였고, 이를 통해 CX3CR1+ 단핵구세포가 수상돌기를 뻗고 있으며, 이를 통해 혈액 내 미생물 유래물질을 특이적으로 인식하고 있음을 알 수 있었다. 장내 미생물의 존재로 인한 골수 내 지속적인 사이토카인 방출은 조혈모 및 전구세포로 하여금 비정상적인 미엘로이드 계열로의 계통분화를 일으킬 가능성이 높다. 이와 관련하여 조혈모 및 전구세포에서 전달된 신호의 감지 및 반응을 조절하기 위한 역치 형성 및 조절기작이 필요하며, 여기에 TRAF6 가 작용할 가능성이 보고된 바 있다. 이에 성체 조혈모 및 전구세포의 정상적인 유지 및 태아 조혈모세포의 형성 및 발달과 관련하여, TRAF6가 세포 내재적으로 조절기능을 가지고 있는지 알아보았다. 이를 위하여 조혈모세포 특이적으로 TRAF6의 제거를 유도한 결과 (T6-ΔH), 해당 생쥐는 19-21일 사이에 모두 사망하였고, 비정상적인 치아 및 골수의 형성을 보였다. 출생 후의 이른 사망원인이 태아 상태에서부터의 비정상적인 조혈과정으로 인한 것인지 조사한 결과, 정상 대조군 생쥐보다 태아 간세포의 조혈모 및 전구세포가 증식되어 있는 것을 발견하였고, 태아 간세포의 조혈작용에 대한 억제조절기작으로 TRAF6가 기능함을 확인하였다. 반대로, 출생 19일째의 생쥐의 골수에서는 조혈모 및 전구세포의 비율 및 세포수가 감소해있음을 관할하였고, 이를 통해 출생 이후의 골수 내 조혈모 및 전구세포의 항상성에 TRAF6가 길항작용을 함을 알 수 있었다. 출생 후의 이른 사망으로 인하여 성체 줄기세포에서의 TRAF6 기능을 확인할 수 없었기 때문에, 정상 대조군과 T6-ΔH 유래 조혈모세포를 이식한 키메라 생쥐를 제작한 결과, 두 조혈모세포들의 혈액재구성 등의 기능상 차이가 없음을 관찰했다. 즉, 성체 조혈모 및 전구세포에서는 TRAF6 제거로 인한 조혈과정의 차이가없음이 관찰되었다. 종합하면, 본 연구를 통해 태아 조혈과정과 개체 탄생 이후 골수에서의 조혈과정에 TRAF6가 각기 다른 방식으로 작용하며, 성체 줄기세포의 경우 골수 내 CX3CR1+ 단핵구세포가 성체의 조혈모 및 전구세포의 미엘로이드 계통의 혈액세포를 생성 및 유지하는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있게 되었다.