이광자 근적외선 형광체 개발 및 퀴논산화환원효소와 지방소립체 형광 프로브의 개발

Abstract

제 1장. 근적외선 방출 파장을 갖는 형광체 및 세포 기관 감지 능력 개발 생물학적 구조 및 기능을 기술하는 연구는 질병의 진단 및 치료에 중요하다. 그 중에서 형광체를 이용한 이미징 기술은 높은 선택성, 빠른 검출 시간, 저렴한 비용등의 장점으로 인해 진단의 필수 도구로써 주목 받고 있다. 공초점 형광 현미경은 세포 혹은 조직을 사용한 형광 감지 도구로써 많이 이용되고 있다. 특히, 이광자 현미경은 광자의 에너지의 절반에 해당하는 파장 때의 레이저를 이용하여, 형광체를 야기시켜 보다 높은 투과성과 낮은 광독성 및 광표백을 나타내는 장점이 있다. 이러한 이광자 현미경은 이광자 흡수 능력을 가진 형광체에만 적용이 가능하므로, 이를 위한 이광자 흡수 형광체의 개발은 필수적이다. 세포내 소기관은 세포의 여러가지 기능을 담당하고 있으며, 이들의 기능적 문제는 다양한 종류의 질병을 야기시킬 수 있다. 새로운 RNA 및 마이토콘리아를 감지하는 형광 분자 프로브를 개발하기 하였으며, 이광자 흡수 능력이 있음을 확인하였고, 세포실험에 응용 되었다. 제 2장. hNQO1 효소 감지 형광 분자 프로브의 개발 세포내 산화 환원의 기능을 담당하고 있는 hNQO1 효소는 암과 관련되어 있는 바이오 마커로 알려져 있다. 암세포에서 과다발현 되어 있는 hNQO1 효소를 감지하기 위하여, 효소에 맞는 퀴논 기능기를 형광체에 부착하여, hNQO1 효소를 감지할 수 있는 형광 분자 프로브를 개발하였다. HT-29 세포에서 hNOQ1 효소를 효과적으로 감지 할 수 있음을 확인 하였으며, 생체 영상화를 통한 질병 진단 및 연구 개발에 도움을 줄 것으로 기대된다. 또한, 추가적인 연구 및 새로운 기능기를 찾기 위하여 다양한 메커니즘을 적용하여, 새로운 hNQO1 프로브를 개발 하고자 하였다. 제 3장. 지방소립 감지 형광 분자 켜짐 방식 프로브의 개발 지방소립은 세포에 에너지 저장 및 지방 대사에 관여 하는 역할을 수행하는 세포내 소기관 이다. 암세포는 타 세포와 비교되는 빠른 성장 메커니즘을 가지고 있다. 암세포는 빠른 성장을 위한 에너지 저장창고의 기능으로써 지방소립체를 이용하며, 정상세포와 비교하여 암세포는 많은 수의 지방소립을 소지하고 있다. 이를 이용하여, 정상세포로부터 암세포를 구분 할 수 있는 바이오마커로써 이용할 수 있으며, 이를 효과적으로 감지 하기 위해 지방소립을 구분할 수 있는 적합한 특성을 지닌 형광체의 개발이 필요하다. 지방소립체의 주요 구성성분이 지방인 점에 착안하여, 지방의 낮은 극성도에 민감하게 반응하기 위한 극성도에 의존적인 형광체를 개발하였다. 세포실험을 통하여 개발된 형광체가 의도한 대로 역할을 수행하였으며, 특히 람다스택을 통해, 지방세포의 방출파장 변화도 감지 할 수 있었다. 제 4장. 지방소립 감지 형광 분자 프로브의 개발 대표적인 ICT 형광체 아세단을 기반으로 Locked 형태의 유도체를 합성하였으며, 지방소립체에서 선택적으로 형광 방출 파장이 변화함을 확인 할 수 있었다. Turn on 방식과 Ratiometric방식의 프로브를 개발하였으며, 특히, 현재까지 Ratiometric 방식의 지방소립체 감지 프로브는 매우 적다. 유기용매내 극성별 방출형광 파장과 정합하여 지방소립체의 극성을 측정할 수 있었으며, 이와 같은 프로브의 능력이 생물학적 연구에 도움을 줄 것으로 기대된다.

Chapter I. Development of near-infrared emissive dyes, RNA and mitochondria targeting dyes. Microscopic imaging aided with fluorescent probes is essential to monitoring of biological processes. To avoid the autofluorescence from innate biomolecules, fluorophores that are emissive in the deep-red/near-infrared (NIR) region are in great demand. For long-term imaging of cells and for deep-tissue imaging, two-photon microscopy aided with two-photon absorbing dyes has advantages over the conventional one-photon confocal laser scanning microscopy. I have developed three deep-red/NIR-emitting, dipolor dyes that contain a vinylnaphthalene core substituted at opposite sites with an amine donor and an acceptor such as tricyanofuran, quinolinium, and pyridinium groups, respectively. The new dyes provided bright cellular images including two-photon microscopic images. The latter two dyes showed selective localization in the nuclei and mitochondria, respectively. Chapter II. Development of hNQO1 fluorescence probes. The cellular oxidation and reduction (redox) cycle is a key biological process. hNQO1, a human quinone oxidoreductase involved in the redox cycle, is overexpressed in breast, ovary, and colon cancers and thus recognized as a potential cancer biomarker. Accordingly, a handful number of fluorescent hNQO1probes have been developed, most of which are one-photon probes and also sense the enzyme in the fluorescence turn-on mode. To develop fluorescent probes with improved sensing properties, by adopting the known “trimethyl-lock quinone (TMQ)” reactive group I have investigated several probe candidates that are based on benzothiazolyl- and pyridinium-benzocoumarin dyes (BtBC and Py+BC) or form a benzocoumarin end-product. Among the probes, only the Py+BC-based one showed ratiometric signal response to the enzyme with marginal peak separation, and the others responded with fluorescence turn-on mode. The BtBC-based probe, although it senses in the turn-on mode, provided bright cellular images and thus has potential for future application.

Chapter III. Development of turn-on fluorescence probes for lipid droplets. Lipid droplet (LD), a dynamic intracellular organelle that is confined by a phospholipid monolayer associated with proteins, stores neutral lipids. LDs play central roles in energy homeostasis and lipid metabolism, and are associated with various human diseases, including cancer. So far, a dozen of fluorescent probes for LDs have been reported, by exploring the more viscous or the less polar environment of LDs compared with that of cytosol. Most of the probes, however, emit below 630 nm where the autofluorescence interference becomes significant. Through a rational design, I developed a fluorescent probe based on the vinylnaphthalene-based tricyanofuran dye (Chapter 1). The probe emits strong fluorescence not only in a highly viscous environment but also in a non-polar environment, two characteristics that LDs offer. The selective detection of LDs was demonstrated by several in cellulo imaging experiments toward HeLa cells under starvation and under an excess level of oleic acid, and 3T3-L1 cells that differentiate into an adipocyte-like phenotype. The probe will find usefulness in studying the biological processes associated with LDs. Chapter IV. Development of ratiometric fluorescence probes for lipid droplets. Environment-dependent emission is a distinctive character of ICT dyes. Based on acedan, a typical ICT dye, I synthesized two N-locked acedan derivatives: N-iodopropyl (LD1) and N-heptyl (LD2) analogues. Interestingly, LD1 sensed lipid droplets (LDs) with ratiometric fluorescence change whereas LD2 with turn-on change: LD1 emits green fluorescence in cytosol but blue fluorescence in LDs due to environmental difference, whereas LD2 emits poor fluorescence in cytosol. The reason why LD1 emits in cytosol but LD2 does not, which leads to their contrasting sensing behaviour. Considering that ratiometric LD probes are in scarce, LD1 provides a valuable tool for studying LD biology.