Fabrication of Multi-Functional Microparticles(MFMs) for the Evaluation of NK Cell Functions

Abstract

Natural killer (NK) cells are a subset of innate lymphoid cells playing an important role in immune surveillance. They can recognize and directly kill infected or tumor cells. At the same time, they produce various cytokines and chemokines to regulate other immune cells. NK cell activity can be a useful marker for health screenings because impaired NK cell functions can lead to disease susceptibility. In addition, tumor patients tend to have low NK cell activities due to tumor-mediated immunosuppression. Indeed, NK cell activity assay based on interferon γ (IFN-γ) secretion measurement using cytokine-stimulated blood cells has recently been used in clinics for quantitative evaluation of NK cell activity. However, IFN-γ secretion is only one aspect of NK cell activity, thus this assay only provided limited information on NK cell activity. An assay that allows simultaneous detection of cytokine secretion and cytotoxicity would be more desirable to assess full NK cell activity. To this end, we fabricated microparticles decorated with multiple functional biomolecules, including antibodies that stimulate NK cells by engaging NK cell activating receptors, antibodies that can capture cytokines secreted by NK cells, and a peptide sensor that reacts with granzyme B, a key molecule released by NK cells for cytotoxicity. Then, the performances of multi-functional microparticles in detecting various NK cell activities were assessed using flow cytometry and live cell imaging.

자연살해(NK)세포는 선천성 면역 세포의 일종으로 세포독성 분자를 분비해 감염 세포를 직접 살상하거나, 사이토카인 분비를 통해 다른 면역 작용을 조절한다. 면역 체계의 최전방인NK세포의 기능이 손상 될 시 질병 감수성 유발로 이어질 수 있으며, 실제로 암 환자의 NK세포 활성이 낮아지는 경향이 보고 되면서 NK세포의 활성은 면역력 및 건강 검진에서 유용한 지표가 되고있다. 최근 병원에서는 사이토카인 칵테일로 자극시킨 혈액세포에서 분비된 IFN-γ를 ELISA로 측정하는 NK세포 활성 측정 키트가 사용되고 있다. 이때 세포독성은 51Cr 방출 분석을 통해 별도로 측정되는데, NK세포의 기능에 대한 한정적인 정보 제공 뿐 아니라 낮은 재현성, 긴 반응시간, 살아있는 표적세포 유지 등의 단점이 있다. 즉, NK세포의 종합적인 활성 기능을 평가하기 위해서는 NK세포의 다중 기능을 동시에 측정하는 방법이 필요하다. 따라서 본 논문에서는 NK세포를 특이적으로 자극하는 동시에, NK세포의 세포독성물질 및 사이토카인 분비라는 두 가지 기능을 측정할 수 있는 다중 기능성 미세 입자 (MFM)를 제조했으며, 그 성능을 유세포 분석 및 생세포영상을 이용해 평가했다. 우선 NK세포 활성화를 자극하고, 분비된 그랜자임 비와 IFN-γ를 검출할 수 있는 생체분자들을 사용해 MFM을 제작한 후, 그랜자임 비와 IFN-γ에 대한 반응성을 확인했다. 다음으로 MFM을 사용해 NK세포를 특이적으로 자극시키고, 유도된 NK세포의 활성을 유세포 분석을 통해 간단하게 측정할 수 있음을 확인했다. 또한 생세포 영상으로 MFM/NK세포의 상호작용과 MFM의 형광 변화 간의 연관성을 분석해 MFM의 기능 검증 뿐 아니라 NK세포의 활성에 대해 단세포 수준에서 분석했다. 마지막으로 MFM을 사용해 NK세포주의 활성과, 배양 시 사이토카인 처리 농도를 다르게 해준 NK세포의 활성을 측정했다. 이를 ELISA결과와 비교하여 기존의 활성 측정 방법과의 상관성과, NK세포 활성 측정법으로서 MFM의 유용성 및 가능성을 확인했다.