Separation of Extracellular Vesicles using Aqueous Two Phase System and its Application

Abstract

Extracellular vesicles (EVs) such as exosomes and microvesicles released from cells are potential biomarkers for liquid biopsy-based diagnostic applications. However, existing EVs isolation methods have low efficiency, purity, and long process time and, therefore, low diagnostic ability. Here, I used an aqueous two-phase system (ATPS) for EV isolation and organized the theoretical background and analysis models to explain the particle separation in ATPSs. In addition, I introduced ATPS for prostate cancer diagnosis using EVs. Three sets of findings are reported here. An interface that has low interfacial tension (10 ~ 60 μJ/m2) that develops in the ATPS has activity similar to that of a filter that has pores of size 40 ~ 100 nm. ATPS isolates EVs with ~100% efficiency from plasma and urine, with 14 times as high as achieved by ultracentrifugation. ATPS successfully differentiates prostate cancer (PCA) from benign prostate hyperplasia (BPH) with higher specificity and selectivity than conventional diagnostic methods such as urine sediments and serum PSA. These revelations will facilitate the use of ATPSs to separate EVs for diagnostic purposes.

세포가 분비하는 세포 밖 소포체는 모세포의 정보를 담고 있어 진단 마커로써 잠재적인 가치를 가진다. 분비된 세포 밖 소포체는 체액을 통해 순환되고 있어 액상 생검으로 검출할 수 있다. 그런데 체액에 존재하는 LDL과 HDL은 세포 밖 소포체와 크기와 형태가 유사하며 Albumin은 세포 밖 소포체 대비 많은 양이 존재한다. LDL, HDL, Albumin을 포함한 불순물은 진단에서 주로 이용되는 RNA 또는 단백질 분석 기법에 영향을 줄 수 있어 불순물을 제거하는 것은 진단에 있어 중요하다. 또한 분리한 세포 밖 소포체의 양이 적으면 진단 마커 검출에 제한을 주기 때문에 높은 수율로 세포 밖 소포체를 분리할 수 있어야 한다. 하지만 기존 세포 밖 소포체 분리 기술은 순도가 높으면 수율이 낮고 수율이 높으면 순도가 낮아 두가지를 모두 높일 수 있는 방법이 요구되고 있다. 본 연구는 이러한 필요성을 만족할 수 있는 방법으로 수용액 이상계를 제안했다. 수용액 이상계는 서로 섞이지 않는 수용액 상으로 이루어져 있으며 유기 용매와 수용액을 이용한 입자 분리 방법과 그 원리가 유사하다. 덱스트란 (Dextran)과 폴리에틸렌글리콜 (Polyethylene glycol)로 구성된 수용액 이상계에서 세포가 덱스트란 층에 강한 친화력을 보이는 점에 착안해서 세포와 표면 특성이 유사한 세포 밖 소포체도 덱스트란 층에 강한 친화력을 보일 것으로 예상했다. 실험 결과 예상한 것과 같이 세포 밖 소포체는 덱스트란 층에 강한 친화력을 가지는 것을 확인했다. 본 연구에서Young’s equation과 Flory-Huggins theory를 기반으로 세포 밖 소포체를 효율적으로 분리할 수 있는 수용액 이상계 시스템을 최적화했으며 최종적으로 100%의 효율과 기존의 원심분리 방법보다 더 높은 순도로 세포 밖 소포체를 분리할 수 있는 방법을 개발했다. 그런데 이러한 일련의 개발 과정에서 답할 수 없는 의문이 생겼다. 수용액 이상계는 물이 공통적으로 포함되고 있어 물과 기름처럼 확연한 친화도 차이를 보이지 않기 때문에 어떤 입자가 아무리 한쪽 수용액 상에 높은 친화도가 있더라도 입자가 100%로 분리되는 것은 설득력이 없었다. 그리고 수용액 이상계의 상분리 단계 이후 시간이 지날수록 특정 입자가 경계면으로 모이는 것을 확인했다. 매 실험을 할 때마다 실험 오차가 크게 발생했다. 본 연구의 초기 단계에서 기존 이론들로 이를 해석하려고 했지만 의문에 대한 답을 찾는데 실패했다. 수용액 이상계에서 어떠한 과정을 거쳐서 입자가 분리되는지 설명할 수 있는 방법이 필요했다. 먼저 경계면 근처에서 일어나는 현상에 집중했다. 입자의 관점에서 수용액 경계면에는 퍼텐셜 우물(Potential well)이 형성되어 있었다. 그런데 입자가 퍼텐셜 우물을 통과하는 과정은 화학 반응의 과정과 매우 유사했다. 본 연구에서 화학 반응의 공식들을 경계면 근처에서 일어나는 입자의 유동에 맞게 변형했다. Kramer theory와 Fick’s law를 이용했으며 시뮬레이션과 실험을 통해 입증했다. 그 결과 낮은 경계 장력 (10 ~ 60 μJ/m2)을 가진 수용액 경계면은 나노 크기의 필터처럼 작용한다는 것을 확인했다. 이를 바탕으로 기존의 의문들에 대해 답할 수 있었다. 세포 밖 소포체는 경계면으로 가는 것이며 기존에 덱스트란 상으로 농축이 되는 것으로 파악했던 것은 수용액 이상계가 수반하는 교반 (Mixing) 과정과 원심분리 (Centrifugation) 과정에서 외력이 발생했기 때문이다. 따라서 외력이 없어진 상태에서 세포 밖 소포체는 결국 경계면으로 이동했다. 이러한 외력은 random하게 발생할 수 있기 때문에 실험 오차를 유발하는 주 원인이었다. 따라서 교반 과정과 원심분리 과정은 오히려 수용액 이상계를 이용한 입자 분리를 예측할 수 없게 만들며 분리 과정에서 순도를 저하시킬 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 교반 과정과 원심분리 과정 없이 입자를 분리할 수 있는 방법이 필요했다. 하지만 교반과 원심분리 없이는 입자 분리를 빠르게 수행할 수 없었다. 본 연구는 좁은 관 안에서 형성되는 Hill’s vortex를 이용하여 이 문제를 해결했다. 실험과 시뮬레이션을 바탕으로 vortex가 입자의 분리를 가속시킬 수 있다는 것을 증명했다. 본 연구에서는 수용액 이상계를 전립선암 진단에 적용했다. 전립선암은 다른 암과 달리 영상 기법으로 진단을 하기 어렵다. 액상 생검 방식으로 PSA를 이용한 진단 방법이 있지만 높은 위양성율을 보이기 때문에 더 나은 진단 마커가 요구되고 있다. 세포 밖 소포체는 기존의 진단 방법을 해결할 수 있을 것으로 판단했다. 전립선 암 환자와 전립선 비대증 환자의 소변의 세포 밖 소포체를 수용액 이상계를 이용해서 분리했다. 분리한 세포 밖 소포체의 단백질과 유전체를 분석했을 때 전립선 비대증 환자와 암 환자간에 유의미한 차이가 있음을 확인했다. 세포 밖 소포체를 이용해서 진단했을 때 기존의 방법보다 진단 성공률이 약 25% 더 향상되는 것을 확인했다. 본 연구는 수용액 이상계를 이용한 입자 분리의 원리, 세포 밖 소포체 분리로의 적용, 전립선 암 진단을 위한 응용에 대해 고민하고 방법을 찾아가는 과정이었다. 본 학위 논문에 기록한 고민의 과정들이 수용액 이상계 기반 나노 입자 분리에 대한 이해를 돕고 더 나아가 진단에 기여할 수 있을 것으로 기대한다.