대장균에서 3-하이드록시프로피온산 생산을 위한 말로닐-CoA 기반 대사 경로의 최적화 연구

Abstract

3-HP는 고부가가치 화합물의 전구체가 되는 플랫폼 화합물이며 합성 플라스틱의 주 원료인 아크릴산 같은 고부가가치 화합물의 전구체가 될 수 있다. 3-HP는 이산화탄소를 고정할 수 있는 광합성 세균인 Chroloflexus aurantiacus로부터 말로닐-CoA 환원효소(MCR)를 이용하여 생물학적으로 합성될 수 있다. 이 합성경로는 다양한 탄소원을 사용할 수 있다는 점에서 매력적이지만 전구체인 말로닐-CoA가 지방산 합성에 주로 이용되므로 이 흐름을 최적화하는 것이 중요하다. 본 연구는 크게 두 부분으로 나뉘며, 그 중 첫 번째는 잠재적 대체 탄소원인 아세트산으로부터 3-HP를 생산하기 위한 대장균 엔지니어링에 관한 내용이다. 아세트산은 매우 풍부하게 자연에 존재하고 있는 탄소원으로 다양한 고부가가치 화합물을 생물학적으로 생산할 때 잠재성이 높은 대체 탄소원이다. 하지만 대장균이 선호하는 탄소원이 아니기 때문에 이와 관련된 개량이 필요하다. 본 연구에서는 우선 3-HP를 대장균에서 생산하기 위해 MCR을 대장균에 도입시켰다. 이 때, 선행연구를 참고해 MCR의 활성을 증가시키기 위해 암호화 서열 중 세 곳의 아미노산 서열을 바꿔 주었고, 최대 발현량을 가지도록 강한 프로모터와 합성 5’ UTR 서열 하에 발현되도록 플라스미드를 구축했다. 다음으로 대장균이 아세트산을 잘 대사 할 수 있도록 아세트산 합성 효소(ACS)를 과발현하고 글리옥실산 합성경로의 억제인자를 코딩하는 유전자(IclR)를 제거했다. 이 전략들을 조합적으로 사용하여 아세트산 대사능이 향상되고 3-HP도 생산할 수 있는 균주를 확보했다. 그 후에, 말로닐-CoA양을 늘리기 위해 본 연구에서는 지방산 합성경로에 관여하는 효소인 FabB와 FabF를 되먹임 억제하는 항생제인 설룰레닌을 첨가함으로써 지방산 합성으로 가는 흐름을 감소시킨 후, 3-HP 생산을 확인했다. 그 결과 3-HP 생산성이 상당히 향상된 것을 확인했다(8.98 g/L 아세트산 중 3.00 g/L 3HP 생산). 두 번째는, 3-HP 생산량을 증가시키기 위해 사용하는 설룰레닌을 사용하지 않고 좀 더 탄소 흐름을 세밀하게 조절할 수 있는 유전자 회로를 개발한 내용이다. 우선 지방산 합성으로 가는 탄소 흐름을 줄여주기 위해 지방산 합성에 관여하는 효소 중 오페론을 형성하고 있는 FabHDG를 유전자 회로 적용 대상으로 선정했다. 유전자 회로는 두 개의 독립적인 전사 억제자(TetR, PhlF)와 그에 상응하는 프로모터들을 포함하며 이들은 논리 회로 중 Not 게이트를 형성하도록 구축되었다. 게다가, 본 연구에서는 억제자들의 억제 정도를 좀 더 세밀히 조절하기 위해 발현량을 다양화 함으로써 다양한 버전의 유전자 회로를 만들었고 이들을 3-HP 생산 균주에 도입함으로써 그 효과를 확인했다. 그 결과, 유전자 회로를 도입하지 않은 생산균주 보다 3-HP 생산량이 약 24,5배 증가했다(3.18 g/L). 최종 결과, 본 연구에서는 대체 탄소원인 아세트산으로부터 3-HP 생산을 확인함으로써 그 잠재성을 확인했고, 목적화합물을 생산할 때 전구체의 양을 최적화하는 것이 생산을 위한 효과적인 접근법이라는 것을 증명했다. 뿐만 아니라 개발한 NOT 게이트 유전자 회로를 통해 말로닐-CoA가 지방산 합성으로 가는 탄소 흐름을 좀 더 세밀히 조절할 수 있음을 확인했고, 이는 3-HP 뿐만 아니라 말로닐-CoA 기반의 다른 고부가가치 화합물을 생산할 때도 응용가능성이 있음을 시사한다.

3-Hydroxypropioic acid (3-HP) is a promising platform chemical for the production of a variety of industrial compounds such as acrylic acid and propiolactone. It can be biologically produced from the reduction of malonyl-CoA, catalyzed by malonyl-CoA reductase (MCR) from Chroloflexus aurantiacus. Although this pathway is highly attractive to produce 3-HP from broad carbon sources, it has been known that the activity of this pathway is not sufficient. Moreover, it requires a precise flux optimization as malonyl-CoA is also an important precursor for fatty acid synthesis. In this study, the results consist of two parts. In part I, we produced 3-HP from acetate with engineered Escherichia coli. Acetate, which is an abundant carbon source, can be a potential alternative feedstock for microbial process to produce diverse value-added chemicals. For efficient conversion of acetate to 3-HP, we initially introduced MCR. Then, acetate assimilating pathway and glyoxylate shunt pathway were activated for efficient acetate consumption. For increasing the malonyl-CoA pool, we decreased carbon flux to fatty acid synthesis by adding cerulenin. Subsequently, we found that inhibiting fatty acid synthesis dramatically improved 3-HP production (3.00 g/L 3-HP from 8.98 g/L acetate). The results indicated that acetate can be used as a promising carbon source for microbial processes and that 3-HP can be produced from acetate with a high yield (44.6% of theoretical maximum yield). In part II, we developed a genetic circuit that was able to more precisely control flux toward fatty acid synthesis and independent of cerulenin to improve the production of 3-HP. At first, we amplified the MCR pathway by maximal expression of genes encoding MCR enzyme as well as other pathway enzymes. Thereafter, for flux optimization, we constructed a genetic circuit to reduce the flux toward fatty acid synthesis by lowering expression of key genes. Specifically, we combined two orthogonal transcriptional repressors (TetR and PhlF) and their cognate promoters to construct logic NOT gate. Furthermore, we tuned the developed circuit by changing the expression level of a repressor to modulate the extent of repression. By using the tuned circuit, we were able to significantly improve the 3-HP production (3.18 g/L, 24.5-fold increase) compared to that of parental strain. Consequently, we proved that acetate can be efficiently converted to 3-HP via engineered microbial process and optimizing the availability of direct precursors by precisely controlling is an effective approach for the biological production of the target compound