Study on a G-type ATP binding cassette transporter required for flower and leaf development in Arabidopsis thaliana

Abstract

Abscisic acid (ABA) is a representative plant stress hormone, which mediates responses to water stress and regulates stomatal closure and root development. In addition to stress response, ABA is also an important hormone for development: inhibition of seed germination, regulation of cell division and elongation, and regulation of flowering. Biosynthesis, transport, and signal transduction of ABA in combination, are necessary for normal function of ABA to regulate stress responses and developmental control. ATP binding cassette (ABC) transporters are enriched in terrestrial plants, and it was suggested that ABC transporters play an important role in land environment adaptation. Several ABC transporters in G sub-group of ABC (ABCG) proteins were reported to transport ABA, which regulate stomatal movement and seed germination. Since the developmental processes that are mediated by ABA are diverse and critical for the survival of plants, I suspected that there must be additional ABCG transporters that mediate development regulated by ABA in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). To find the candidate, I searched transcriptomic data for ABCG transporters whose expression is induced by ABA. Among the ABCGs upregulated in response to ABA, ABCG27 was reported to be preferentially expressed in guard cells, but the abcg27 knockout mutant was reported to exhibit no difference in stomatal movement compared to wild-type. I observed the apparent phenotype of the abcg27 knockout mutant and found two developmental defects: long pistil and epinastic leaf. The knockout had longer pistil than the wild-type, resulting in self-fertilization failure and short silique. The leaf of the knockout exhibited a downward-curling shape. The expression of ABCG27 was induced 3-fold when flower buds were exposed to exogenous ABA, and the promoter of ABCG27 had two ABA responsive elements, suggesting the function of ABCG27 in relation to ABA. To find the correlation between ABCG27 and ABA, I measured ABA contents and found that ABA contents in the pistil, the true leaf, and the whole shoot were higher in the abcg27 knockout than in the wild-type. To test whether high ABA content resulted in developmental change, the detached pistil was exposed to exogenous ABA. The pistils treated with ABA grew longer than those of the control. In Arabidopsis seedlings, the expression of ABCG27 was exclusively detected in shoot. In the flower, the expression was enriched especially in the flower receptacle and the pistil. The fluorescence protein fused ABCG27 was localized in the plasma membrane when it was expressed in Arabidopsis mesophyll protoplasts. To find a detailed mechanism of how ABCG27 contributed to the development of organs, I analyzed the transcriptome from the pistil and the true leaf of the wild-type and the abcg27 knockout. From the analysis, I found that organ development related genes were changed in the knockout, and notably, the expression of ta-si RNA processing enzyme genes, which regulate flower and leaf development, was low in the knockout. Based on the experimental results I obtained and referring the previous literature in this field, I suggest that ABCG27, most likely functioning as an ABA uptake transporter, regulates ABA level in ABA synthesizing cells. This study identified a function of a novel ABC transporter ABCG27, and in addition, the role of ABA in the development of pistil and leaf under non-stressed conditions.

앱시스산(ABA)은 대표적인 식물 스트레스 호르몬으로, 물 부족에 따라 기공을 닫고 뿌리의 발달을 조절하는 역할을 한다. 그 뿐만 아니라 발달에도 중요하여, 종자 발아를 막으며, 세포 분열과 부피 생장, 개화를 조절한다. ABA의 합성과 수송, 그리고 신호 전달 체계는 위의 역할을 올바로 하는데 중요한 역할을 한다. 다른 생명체에 비해 지상 식물은 ATP 결합 수송체 (ABC 수송체)의 숫자가 많으며, 이러한 현상은 식물의 지상 적응에 ABC 수송체가 중요한 역할을 담당함을 시사하였다. 식물에서 ABA를 수송하는 G 유형 ABC (ABCG) 수송체 몇 가지가 발견되었으며, 기공 운동 조절 및 종자 발아 조절에 그 역할을 수행함이 밝혀졌다. ABA에 의해 조절되는 발달과정이 육상식물의 생활사에 지대한 중요성을 가짐에 근거하여, 본인은 이 연구에서 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 ABA가 조절하는 발달과정에 관여하는 ABC 수송체를 찾고자 하였다. 그 후보 ABC 수송체를 찾는 방법으로 ABA에 의해 발현이 유도되는 ABC 수송체를 전사체 데이터를 분석하였다. ABA에 의해 발현이 올라가는 ABC 수송체 중 ABCG27은 공변세포에 주로 발현하는 것으로 알려졌으나, 결손 돌연변이체는 기공 운동에 변화를 보이지 않았음이 보고되었다. abcg27 결손 돌연변이체의 외형을 직접 관찰한 결과, 꽃의 암술이 야생종에 비해 길게 생장하여 자화 수분에 실패하고, 그에 따라 씨 꼬투리의 길이가 짧았다. 또한 결손 돌연변이체는 잎이 아래쪽으로 말린 형태로 발달했다. ABCG27은 꽃봉오리에 ABA를 처리했을 때 발현이 3배 증가하였으며, ABCG27의 프로모터에는 ABA에 반응하는 염기 서열이 있었다. ABA와 관련된 변화가 있는지 확인하기 위해 조직 내 ABA함량을 측정한 결과 암술, 잎, 지상부에서 abcg27 결손 돌연변이체가 야생종에 비해 높은 ABA 함량을 보였다. 높은 ABA 함량이 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해, 야생종 애기장대 암술을 분리하여ABA를 처리한 결과, 대조군에 비해 암술 생장이 촉진됨을 확인했다. 이는 abcg27 돌연변이체의 높은 ABA 함량이 암술의 과다 생장의 원인이 될 수 있음을 시사한다. 애기장대 조직에서 ABCG27이 뿌리보다는 지상부에 주로 발현하며, 꽃에서는 꽃자루와 암술에 주로 발현함을 확인했다. 분리된 애기장대 엽육 조직 세포에서 형광 단백질을 붙인 ABCG27를 발현하여 세포 내 위치를 확인한 결과 원형질막에 위치함을 관찰했다. ABCG27이 발달에 기여하는 기전을 알기 위해 표현형이 나타나는 암술과 잎에서 야생종과 결손 돌연변이체의 전사체를 분석한 결과, 기관 발달에 관여하는 유전자들의 변화를 관찰했으며, 그 중에서도 꽃과 잎의 발달에 관여하는 ta-si RNA의 처리 과정에 관여하는 유전자들의 발현변화를 관찰했다. 위 실험 결과와 이전 연구를 종합하여, ABCG27이 발달하고 있는 꽃과 잎의 ABA를 합성하는 세포들에서 ABA를 흡수하여 적절한 조직 내 ABA 함량을 유지하는데 기여하는 수송체임을 제안하였다. 이 연구는 애기장대의 한 가지 ABC 수송체의 기능을 밝혔으며, 스트레스 상황이 아닌 정상 발달과정에서 ABA가 꽃과 잎의 발달에 중요하다는 것을 보였다.