Development of 1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid specific RNA aptamers by using falling-off SELEX toward construction of riboswtiches

Abstract

라이보스위치는 알앤에이 기반의 새로운 유전자 회로로써 다양한 분야에서 사용할 수 있는 라이보스위치를 개발하고자 하였다. 라이보스위치는 세포의 대사회로를 자유로이 조절 할 수 있는 새로운 대안책으로써 제시된다. 기존 단백질 기반의 센서와는 달리, 세포의 단백질 합성 과정에서 문제를 야기할 확률이 적을 뿐만 아니라 원하는 물질을 감지할 수 있는 압타머를 발굴 하게 되면 쉽게 제작 할 수 있다는 것이 큰 장점이다. 따라서 새로운 라이보스위치를 발굴하여 이것을 활용해 미생물 기반의 산업적 용도 뿐만 아니라 새로운 고생산 균주를 효과적으로 찾는 것이 가능할 수 있다. 라이보스위치의 기본 원리는 원하는 물질을 감지하고 이에 따라서 단백질의 발현량을 조절 하는 것이다. 따라서 단백질 원하는 물질에 빠르고 민감하게 반응하여 구조가 변화할 수 있는 압타머의 발굴이 무엇보다 중요한 과정의 일부이다. 본 연구에서는 이러한 압타머를 찾기 위해서 작은 분자를 찾기 위해 유리하다고 알려진 capture SELEX 기술을 활용하였다. 해당 실험 법의 경우, 분자의 작용기가 용액상에 녹아있는 상태로 존재 할 수 있는 것이 가장 큰 장점이다. 뿐만 아니라 기존의 matrix를 제작해서 진행했던 SELEX와는 달리, 용액에 녹이기만 하면 되기 때문에 비용적인 절감에 있어서도 장점을 드러내고 있다. 본 연구에서는, 비타민 K2 전구체인 DHNA를 감지하고 이에 따라 형광 단백질이 발현 될 수 있는 라이보스위치를 구축하여, FACS를 활용해 고생산 균주를 효율 적으로 찾아내고자 하였다. 이를 위해 DHNA에 반응하는 압타머를 찾았다. 뿐만 아니라, 비자연 아미노산의 일종인 AZF를 감지 할 수 있는 압타머도 찾고자 했다. 이를 통해 AZF를 활용해서 단백질을 합성하는 대표적인 산업은 약물 합성 산업에 활용해, 공정비의 절감을 꾀하였다.

A Riboswitch is an RNA based genetic circuit that is well known for rewiring cellular behavior. Compared with a protein based genetic circuit like transcription factor and cognate promoter set, riboswitches can reduce metabolic burden and control genetic behavior fast. Like protein based genetic circuits, it can be used for screening devices, production control, microbial cell factory. If we make a riboswitch which is controlled by new types of small molecules, we can engineer cellular behavior effectively. The construction of this type of riboswitch, I try to find new 2 types of aptamers which can be isolated by capture SELEX. First, I wanted to find out 1,4-Dihydroxy-2-naphthoic(DHNA) acids capturing aptamers to make riboswitch. Because this substrate is a key intermediate of vitamin K2, I try to construct DHNA specific riboswitch which can be used as a screening device to isolate high producers by FACS. And these days, Drugs are conjugated with non-natural amino acids to enhancing their stability. And to make non-natural amino acids incorporated into proteins, many corporations control these systems by using IPTG which is one of the inducers. For reducing industrial cost for the synthesis of p-azido-phenylalanine (AZF) incorporated proteins, I made an effort to find AZF specific binding aptamers to construct AZF specific inducing systems.