Signal amplification strategies in aptamer-based biomarker detection

Abstract

A biomarker is a biomolecule whose concentration changes in blood, body fluid, and tissue of the human body according to the degree of disease progression, and a biosensor aims to diagnose a disease and predict a prognosis by detecting these biomarkers. For the development of biosensors, a probe that specifically binds to each biomarker is required. A typical example is an antibody, and many biosensors using antibodies have been studied due to their high specificity and sensitivity. However, antibodies are large in size, have to be produced in cells that the process is time consuming and expensive. Chemical modification of antibodies is also difficult, and antibodies are sensitive to the surrounding environment, which affects the performance and stability of the sensor according to changes in pH or temperature. As a substitute for it, aptamers received attention. Aptamers are oligonucleotides with binding affinity to specific molecules, can be amplified, have high environmental stability, and reversible structural recovery through cooling after heating, making it easier to maintain long-term performance compared to antibodies. However, the lack of sensitivity compared to antibodies is a challenge that needs to be overcome. In this study, two methods of amplifying the aptamer itself were performed using the fact that the aptamer is an oligonucleotide, in addition to the existing method of amplifying a reporters that is widely used. Reporter amplification was applied to the sandwich-type enzyme-linked aptamer assay (ELAA) for the detection of EN2, a prostate cancer biomarker. HCR was used to increase number of enzyme linked to the probe, as a reporter amplification method, and the HCR reaction was confirmed by adding a trigger sequence to the L34 aptamer used as a conventional detector. In order to improve the signal-to-noise ratio, optimization experiments such as the length of the spacer sequence and the concentration ratio of trigger and hairpin were performed. In the detection applying this, the signal strength was improved by about 3 times compared to the sensor without HCR. LOD was decreased 31.5% compared to the basic ELAA. Also, experiments to facilitate hairpin opening by introducing a mismatch in the formation of HCR were conducted. As a result, it is expected that successful biosensor development will be possible by verifying the sensor optimization experiment and effectiveness in actual patient samples. The amplification method of the probe was intended to improve the sensitivity by amplifying the aptamer by molecular beacon-based qPCR. Three aptamers that binds to three tuberculosis biomarkers CFP10, ESAT6, and TB7.7 were studied. The loop sequence was designed in consideration of the reduction in cross-reactivity in the complex detection and the back ground signal. A candidate whose melting point was 7 to 10 degrees higher than the annealing temperature when the stem sequence was added was selected. For the synthesized molecular beacons, the signal-to background ratio and thermal denaturation profiles were analyzed. Finally, 12 beacon candidates for each aptamers were selected. Of these, four CG6 aptamer beacons were synthesized and selection was performed. Finally, qPCR quantified the CG4 aptamer up to 10 fM with R2 value of 0.9940 in the sample mixed with three aptamers. In the future, non-invasive, high-accuracy Apta-qPCR can be expected to be established through screening every candidates remained.

바이오마커는 질병의 진행 정도에 따라 인체의 혈액, 체액 및 조직 등에서 농도가 변화하는 생체 분자를 말하며, 바이오센서는 이러한 바이오마커를 검출함으로써 질병의 진단 및 예후 예측을 목적으로 한다. 바이오센서의 개발을 위해서는 각 바이오마커에 특이적으로 결합하는 탐침이 필요하다. 대표적인 예로 항체가 있으며, 높은 특이도와 민감도로 인해 항체를 이용한 많은 바이오센서가 연구되어 왔다. 하지만 항체는 크기가 크고, 세포에서 생산해야 하며, 기간과 비용이 많이 소모된다. 화학적 변형도 어렵고, 주변 환경에 민감하여 pH변화나 온도 변화에 따라 센서의 성능 안정성에 영향을 끼친다. 그에 대한 대체제로서 압타머가 주목 받았다. 압타머는 특정 분자에 결합 친화도를 가지는 올리고뉴클레오타이드로, 증폭이 가능하며, 환경 안정성이 높고, 가열 후 식힘 과정을 통한 가역적 구조회복이 가능해 항체 대비 장기간 성능 유지에 용이하다. 다만 대체로 항체 대비 민감도가 떨어지는 점이 극복해 나가야 할 과제이다. 본 연구에서는 기존의 많이 사용되는 신호 발생 물질을 증폭하는 방법에 더불어, 압타머가 올리고뉴클레오타이드인 점을 이용해, 압타머 자체를 증폭하는 방법 두 가지를 수행하였다. 신호 발생 물질 증폭은 이전 연구에서 개발된 전립선암 바이오마커 EN2 검출을 위한 샌드위치형 효소 결합 압타머 검사 (ELAA)에 적용하였다. 신호 발생 물질 증폭 방법으로 HCR 사용하였으며, 기존의 검출 탐침으로 사용한 L34 압타머에 trigger 서열을 추가하여 HCR 반응이 일어나는 것을 확인하였다. 신호 대비 잡음 비의 향상을 위해 스페이서 서열 길이, trigger와 hairpin의 농도 비 등의 최적화 실험이 수행되었다. 이를 적용한 검출 실험에서 HCR이 부재한 센서 대비 약 3배 가량 향상된 신호 세기와 31.5% 감소된 LOD를 보였다. HCR의 형성에서 mismatch를 도입하여 hairpin의 개방을 용이하게 하는 실험 또한 진행하였다. 이렇게 얻은 결과로 센서의 최적화 실험과 실제 환자 시료에서의 효용성을 확인함으로써 성공적인 바이오센서의 개발이 가능할 것으로 보인다. 압타머 자체를 증폭하는 방법은 세 가지 결핵 바이오마커 CFP10, ESAT6, TB7.7 결합으로는 압타머가 올리고뉴클레오타이드인 것을 이용해 qPCR로 증폭하여 민감도의 향상을 도모하고자 하였다. 복합 검출에서의 cross-reactivity 감소와 back ground signal 등을 고려하여 loop 서열을 설계하였으며, stem 서열을 추가했을 때의 녹는점이 annealing 온도보다 7도~10도 가량 높은 후보군을 선정하였다. 합성된 분자 비콘들에 대해서 신호 대 바탕 비, 열분해 프로파일의 성질 분석을 진행하였다. 최종적으로 12종의 비콘 후보를 선정하였다. 이 중 CG6 압타머를 타겟으로 하는 비콘 4종을 합성해 selection을 수행 하였으며, 최종적으로 압타머가 혼재한 샘플에서도 목표 압타머를 0.9940의 R^2 값으로 10 fM까지 정량하는 비콘을 선별하였다. 나머지 후보군들 중에서 스크리닝을 통해 최종적으로 비침습적이고, 높은 정확도를 가지는 Apta-qPCR의 확립을 기대할 수 있을 것이다.