Towards identification of key components required for Ralstonia effector-triggered immunity

Abstract

Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) is a plant-pathogenic bacterium and cause of bacterial wilt. Once infected, the plant shows rapid fatal wilting symptoms. Consequently, infected plants die. However, R. solanacearum can survive in plant debris or soil for many years, so it is difficult to control and affects over 250 plants in over 40 plant families. For its severity, R. solanacearum race 3, biovar 2 is considered a potential bioterrorist weapon by the U.S government. Plants overcome bacterial attacks by activating the two-layered immune systems. Plant immune signaling is initiated by recognizing pathogens’ molecular patterns by cell surface receptors (PRRs), which is pattern-triggered immunity (PTI). The secondary immune response, effector-triggered immunity (ETI) generates stronger immune responses called hypersensitive response (HR) which is programmed cell death. Penetrated bacteria secrete toxins into plant cells called effectors which are captured by plant intracellular receptors (NLRs) directly or indirectly. Solanaceae families such as tomato, potato, tobacco, eggplant, and pepper are economically important. The Solanum americanum (S. americanum) is a model plant of the Solanaceae family which enabled rapid research on genetics and genomics. Importantly, S. americanum seems to carry bacterial wilt resistance genes. In this study, I propose a rapid identification method with a forward genetics approach using gamma-ray mutagenized S. americanum M2 population to find genes resistant to Ralstonia. The forty-one S. americanum accessions were screened for the hypersensitive responses (HR) induced by transient expression of twenty-seven Ralstonia effectors. The six Ralstonia effectors (RipA1, RipA5, RipAN, RipAV, RipAY, and RipI) triggered HR in multiple S. americanum accessions. S. americanum accessions SP2273 seeds were tested for setting proper gamma-ray dose. I harvest the M2 seeds from 10,000 130 gray treated M1 seeds. Further, The M2 population is screened by the six effectors and molecular mapping. This project suggests a method finding out the critical component genes for bacterial wilt resistance. The discovery of immune components and its mechanistic studies in wild Solanaceae should be crucial for making applicable bacterial wilt disease-resistant crops.

농업과학의 과제 중 하나는 우수한 품종의 점진적인 개발을 통해 농산물의 수확량 안정성을 향상시키는 것이다. 급변하는 기후변화로 농작물에 피해를 주는 감염성 병원균의 수가 증가됨에 따라 질병 저항성 작물 확보에 대한 새로운 전략이 요구되고 있다. 전장 유전체 해독 (whole-genome sequencing) 정보의 접근이 용이해짐에 따라, 전통적인 육종 방법을 능가하는 새로운 과학기술을 육종에 도입하려는 시도가 꾸준히 증가되고 있다. 식물 유전체 연구의 축적으로 식물 병원체 저항성 유전자의 구조와 기능, 질병 유발균의 비병원성 이펙터 (effector) 단백질과 식물의 수용체 사이의 메커니즘이 밝혀지고 있으며, 이를 적용하여 개발한 병 저항성 작물이 포장에서도 유효한지에 대한 연구도 지속되고 있다. 일반적으로 식물 내 질병 저항성 부여는 특정 병원체 단백질을 인식하는 식물 세포 내 NLR(nucleotide-binding leucine-rich repeat)을 코딩하는 단일 수용체 유전자의 도입을 기반으로 한다. 하지만 NLR-유전자의 도입으로 인한 내성은 세대가 내려갈수록 파괴되는 빈도를 나타내며, 따라서 새로운 내성 유전자를 발굴하여 지속적으로 축적하는 것은 육종 프로젝트의 필수적인 요소이다. 세균성 풋마름 병을 일으키는 랄스토니아 솔라나세럼 (Ralstonia solanacearum)은 토마토, 감자, 고추와 같은 가지과 작물을 포함한 넓은 기주범위를 지닌다. 흥미롭게도 양곡 소비량의 하락추세에 비해 토마토, 감자, 고추 등의 소비동향은 꾸준한 증가추세를 보이며, 이러한 가지과 작물들은 식량작물 총 수요량에서도 큰 비중을 차지한다. 미국에서는 풋마름 병원균 ‘R. solanacearum race 3 biovar 2’을 감자 산업에 심각한 위협으로 간주하여 2002년 농업생물테러방지법 선택작물로 등재하였다. 세균성 풋마름병은 식량안보에 위협요소를 지닌 병원균이지만, 윤작 외에 적절한 방제법이 없어 심각한 문제가 되고 있다. 또한 국내에서도 세균성 풋마름병이 전국에서 산발적으로 발병하고 있어서 이에 대응하는 노력이 필요하다. 최근 미국까마중에서 클로닝 한 새로운 유전자인 Rpi-amr1 (NRC helper-dependent CC-NLR)을 감자역병 (potato blight) 감수성 품종에 도입했을 때, 감자 역병균 (Phytophthora infestans)에 대한 저항성을 지닌다는 연구결과가 발표되었다. 미국까마중 (Solanum americanum)은 다양한 유전 자원을 지니고 있는 야생형 가지과 식물의 모델으로, 풋마름 병에 저항하는 유전자를 지닌 것으로 기대된다. 본 연구에서는 다양한 까마중 생태형으로부터 세균성 풋마름 병원균에서 추출한 여러가지 비병원성 이펙터를 활용하여 세균성 풋마름병에 저항성을 띄게 하는 식물 유전자를 찾기 위한 방법을 제시한다. 일반적으로 식물의 대부분은 병원균을 인식하여 면역반응을 일으켜 스스로를 보호한다. 식물의 면역반응 중 가장 강력한 방법인 식물 세포사멸 반응 (hypersensitive response)은 다양한 신호전달을 통하여 일어나며, 병원균이 침입한 위치에서 병원균의 증식을 억제한다. 야생형 까마중 인 SP2273 (S. americanum accession SP2273)은 여러 생태형 중에 유전체가 가장 잘 밝혀져 있다. SP2273에 박테리아의 유전체에서 클로닝한 비병원성 이펙터 유전자를 아그로박테리움 (Agrobacterium AGL1)으로 일시발현 (transient expression)시켰을 때, 식물 세포사멸 반응을 일으킴을 확인하였다. 27개 종류의 랄스토니아 이펙터를 41가지 생태형의 까마중에 발현시켰을 때, 랄스토니아 이펙터와 까마중 생태형의 조합에 따라 각각 다르게 세포사멸 반응이 나타났다. 예를 들어, RipA1GMI1000 을 41가지의 서로 다른 생태형의 까마중에 발현시켰을 때 모든 까마중 생태형에서 세포사멸 반응을 일으켰지만, RipA1PE_13 로는 세포사멸 반응을 일으키는 까마중 생태형이 없었다. 이 스크리닝의 결과를 정리하여, 까마중 생태형의 50% 이상에서 세포사멸 반응을 일으키는 6개의 이펙터 RipA1, RipA5, RipAN, RipAV, RipAY, RipI를 선택할 수 있었고, 이것을 랄스토니아 저항성을 부여하는 스크리닝에 사용하는 후보로 정하였다. 한국 원자력 연구원의 조영득 박사님의 도움으로 0Gy, 50Gy, 100Gy, … 800Gy 감마선을 각 6시간씩 노출한 SP2273 씨앗의 발아율을 측정했을 때, 130Gy에서 약 50%의 발아율을 보였다. 그레이 (Gy)는 흡수 선량에 관한 국제 단위이다. 130Gy를 노출한 까마중 SP2273 M1 식물에서 받은 M2 씨앗을 길러서 앞서 선택한 여섯 가지 랄스토니아 이펙터를 아그로박테리움으로 발현시켜서 세포사멸 반응의 유무를 표현형의 기준으로 나눈다. 이때 M2 식물을 이용하는 이유는 돌연변이가 생긴 유전자가 4분의 1의 확률로 동형 접합체 (homozygote)를 이룰 것을 기대하기 때문이다. 세포사멸 반응이 사라진 식물군에서 DNA를 추출하여 모은 뒤 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing)을 한다. 차세대 염기서열 분석 결과를 기존에 밝혀진 야생형 SP2273 유전체와 비교하여 단일 핵산 염기 다형선상 (Single nucleotide polymorphism, SNP)을 보이는 위치 주변의 NLR을 이펙터에 상호작용하는 후보 NLR으로 선정하여, 분자생물학 방법으로 메커니즘을 확인한다. 식물 세포사멸 반응에 관여하는 요소가 다양하기 때문에, 스크리닝을 통하여 찾게 될 유전자는 기존에 이미 밝혀진 요소이거나, 전혀 새로운 것일 수 있다. 본 연구가 비병원성 이펙터 RipA1, RipA5, RipAN, RipAV, RipAY, RipI를 인식하는 세균성 풋마름병 저항성 발현 핵심 유전인자 탐색하는 데 효과적인 모델을 제시하고, 최종적으로 이를 통해 밝혀진 유전자를 여러 가지과 작물에 도입하여 작물의 세균성 풋마름병 저항성을 증진하는데 이용될 것으로 기대한다.