A Study on the Generation of Intestine Tissue from Mouse Embryonic Stem Cells

Abstract

오가노이드는 배아 줄기세포나 장기 내 성체 줄기세포를 이용하여 3D 배양을 통해 장기 특이적 세포 집합체로 실제 장기와 유사한 형태와 기능을 재현할 수 있는 장기 유사체라 할 수 있다. 본 연구에서 마우스 배아 줄기 세포를 이용해 장 특이적 분화능을 가지도록 유도하여 장 특이적 구조 및 특이적 세포를 포함하는 체외 장 조직을 구현하였으며, 기존의 장 내 성체 줄기세포로부터 유래된 오가노이드와 실제 마우스 장과의 유사도를 비교해 보았다. 기존의 만능줄기세포를 이용해 체외 장 조직 구현 연구에 있어 움-융모의 구조가 불분명하며, 자가 재생에 대한 확인과 전체 유전자 발현에 대한 정보가 부족했기에, 효율적인 유도 배양 방법 연구와 더불어 이러한 문제가 보안 될 수 있는 연구를 수행하였다. 우선적으로 장으로 분화에 있어 첫 단계인 내배엽 세포로의 분화를 고농도 Activin A를 통해 유도하였으며, 필수적 인자라 알려진 Caudal relate homologues genes 2 (CDX2) 의 발현을 증가시키는 기존의 연구를 이용하여 장 상피로의 분화를 매개하였다. CDX2는 전사인자로서 장상피의 증식 및 분화에 관여하는 여러 인자를 조절할 수 있는 인자이며, 이 인자가 소실 될 경우 장 발달에 장애가 초래된다. CDX2 발현이 유도된 구체를 장 오가노이드 배양에 사용되는 배양액에서 배양할 경우 기존의 성체 줄기세포로부터 유도된 장 오가노이드와 매우 유사한 형태를 보였으며, 장 특이적 유전자의 발현도 나타났다. 이를 통해 계속적인 CDX2의 유도 없이도 장 분화능을 가진 상태라면 성숙한 장으로 자연스러운 분화가 계속 될 수 있음을 확인하였다. 유전자 발현 분석을 통해 실제 장 조직과 장내 성체 줄기세포로부터 유도된 장 오가노이드를 비롯하여 내배엽에서 분화하는 위와 비교함으로써, 만능줄기세포로부터 만들어진 장 오가노이드가 장 특이적 분화를 하였음을 확인하였다. 유전자 발현의 정도가 분화 시작 단계인 만능줄기세포와 전혀 다른 양상을 보였으며, 그 양상이 기존의 성체 줄기세포로부터 유도된 장 오가노이드와 높은 일치성을 보였다. 유전자 발현을 촉진하는 히스톤 단백질의 아세틸화 유무를 H3K27ac 히스톤 표지로 확인한 결과, 실제 장 조직과 동일한 위치에 아세틸 표지가 존재했으며, 장 특이적으로 유도된 높은 발현량을 가진 유전자에서 H3K27ac의 존재를 확인하였다. 만능줄기세포로부터 분화를 통해 체외 장 조직을 구현함으로써, 장으로 발달에 있어 단계별로 중요한 유전자 및 분화 제어 기전을 규명할 수 있으며, 유전자 변형이 용이하여 다양한 질환 모델을 만들어 그 특성을 비교할 수 있다. 생체 줄기세포는 그 양이 적어 실험에 한계가 있지만 만능줄기세포는 대량배양이 가능해 약물이나 화학적 효과를 검증함에 있어 만능줄기세포로부터 분화된 오가노이드를 사용할 수 있을 것이다. 실제 장 조직의 구현성을 더 깊은 연구함으로써 다양한 물리적 이식 형태를 통한 체내 적용 가능성을 살펴 볼 필요가 있다.

Direct lineage specification, including with small molecules, has emerged as an innovative approach to understand in vivo development by generating mini-organ in vitro called organoids. During chemical induction to mimic in vivo intestinal development stage, sequentially, mouse embryonic stem cells (ESCs) can be differentiated into definitive endoderm (DE) and into intestinal lineage expressing intestinal specific transcription factor Cdx2. In this study, a method was modified for intestine differentiation from ESCs without inhibitors after inducing Cdx2. Cdx2-inducing culture conditions generated intestinal lineage specified spheroids without crypt-villi structures. Spheroids specified into lineage can be induced into mature intestine tissue by three-dimensional culture without Cdx2-inducing factors. This complex ESCs-derived intestinal organoids (EIOs) patterned into villus and crypt-like structures containing Lgr5+ stem cells, functional enterocytes, as well as goblet cells, Paneth and enteroendocrine cells. Furthermore, EIOs had a self-renewing capacity and could be cultured for long-term expansion. RNA sequencing analysis identified that transcripts were modulated during differentiation of ESCs into EIOs, with high expression of the intestine-restricted transcription factor (TF) gene Cdx2 in only EIOs and it shared similar gene expression profile with in vivo intestine and adult stem cells-derived organoids (AIOs) originated from crypts. Intestinal specific up-regulated genes in EIOs had active histone modification (H327ac) comparable to chromatin state of in vivo intestine tissue on intestine specific gene loci. Through this research, it was identified that the activity of Cdx2 is sufficient and necessary for promoting intestine development.