Design of Diagnostic and Therapeutic Systems using Biomolecule-Nanomaterial Complexes

Abstract

Various cutting-edge technologies have been developed to design and fabricate diagnostic and therapeutic platforms for specific diseases. Of them, biomolecule-nanomaterial hybrids have received considerable attention from scientists and doctors because they have numerous advantages over other methods, such as good biocompatibility, low immunogenicity, and controllable selectivity. In particular, aptamers, oligonucleic acids or peptides that bind to a specific target molecule, and DNAzymes which are DNA molecules with catalytic ability, are regarded as outstanding biomolecules. In this study, diagnostic and therapeutic complexes that use aptamer or DNAzyme and nanomaterials are developed and characterized. A gold nanoparticle-based probe using aptamers was designed for prostate cancer therapy. Currently, although various studies on nanoparticles-based photothermal therapy have been actively performed, epoch-making photothermolysis therapy that exhibits both high selectivity and efficiency has not yet been discovered. For the first time, novel valuable therapeutic complexes, dual aptamer-modified gold nanostars, was developed to target prostate cancers, including prostate-specific membrane antigen (PSMA)(+) and PSMA(–) cells. The synthesized probes were characterized through several techniques, including UV-Vis spectral analysis, DLS analysis, zeta potential measurements, and TEM imaging. They were subsequently subjected to cytotoxicity tests, cell uptake confirmation, and in vitro photothermal therapy. The homogeneously well-fabricated nanostars presented high selectivity to the prostate cancer cells and extremely high efficiency for therapy using an 808 nm laser under an irradiance of 0.3 W/cm2, which is lower than the permitted value of skin (0.329 W/cm2). It is anticipated that this novel photothermal agent will become the general platform for targeted therapy. In addition, aptamer-modified silica nanoparticles were synthesized to diagnose breast cancer. Most of studies on breast cancer-specific detection are restricted within narrow limits because of the deficiency of promising markers. Based on the fact that HER2, as well as MUC1, are over-expressed in breast cancer cell lines, novel diagnostic complexes, dual aptamer-modified silica nanoparticles (dye-doped), were designed to simultaneously target breast cancers including HER2(+) and MUC1(+) cells. The newly synthesized probe was characterized by various methods, such as TEM, DLS, zeta potential measurement, and UV-Vis and fluorescence spectroscopy. Dye-doped silica nanoparticles exhibited homogeneity in size, negative surface charge, and robust fluorescent signal. Furthermore, the developed particles were subjected to a cytotoxicity test, binding test, and selectivity confirmation, resulting in the non-toxic probes being highly sensitive and selective to HER2(+) and MUC1(+) breast cancer cells. Finally, DNAzyme-modified gold nanoparticles were developed for the DNA strand exchange process. Thermostable Thermotoga maritima recombinaseA (TmRecA), a core protein in homologous recombination, and DNAzyme, a catalytic DNA that can cleave to a specific DNA sequence, are introduced in this work. Using a colorimetric method, gold nanoparticles (AuNPs) modified with complementary DNAs were assembled by annealing. Aggregated AuNPs were then separated irreversibly by TmRecA and DNAzyme, which led to a distinct color change in the particles from purple to red. This process was confirmed via other methods. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled DNA as a fluorophore and black hole quencher 1 (BHQ1)-labeled DNA as a quencher were used for fluorometric detection. Successful strand exchange was clearly detected by variations in fluorescence intensity. In addition, alterations to the impedance of a gold electrode with immobilized DNA were employed to monitor the regular exchange of DNA strands. All three methods provided sufficient evidence of efficient strand exchange reactions and have great potential for applications in the monitoring of recombination, the discovery of new DNAzymes, the detection of DNAzymes, and measurement of other protein activities.

특정 질병의 진단 및 치료 시스템을 구축하기 위해 다양한 첨단 기술이 개발되어 왔다. 그 중에서도, 생분자-나노물질 복합체는 우수한 생체적합성, 낮은 면역원성, 조절 가능한 선택성 등의 다양한 장점으로 인해 많은 관심을 받아왔다. 특히, 표적 물질에 선택적으로 결합하는 핵산 및 펩티드인 압타머와, 촉매 활성을 갖는 DNA 기반 효소는 훌륭한 생분자로 여겨진다. 본 연구에서는 진단 및 치료를 위해서 압타머 또는 DNA 기반 효소와 나노물질 간의 복합체를 개발하고 이들의 특성을 규명하였다. 먼저, 전립선암의 치료를 위하여 금나노입자와 압타머 간의 복합체를 합성하였다. 현재, 나노입자 기반의 광열치료가 활발히 행해지고 있지만, 높은 선택성과 효율을 동시에 갖는 광열치료법은 아직 개발되지 않았다. 본 연구에서는 PSMA(+) and PSMA(–) 전립선암 세포를 동시에 표적화 할 수 있는 이중 압타머-금나노 입자 복합체를 처음으로 개발하였다. 합성된 입자는 UV-Vis 스펙트럼 분석, DLS 분석, 표면 전하 측정 및 TEM 이미징 등을 통해 특성이 규명되었다. 그리고 독성 테스트, 세포 내 유입 측정 및 in vitro 광열 치료를 수행하였다. 균일하게 잘 합성된 별 모양의 금나노 입자는 전립선 암에 대해 높은 선택성을 나타내었고 0.3 W/cm2의 세기를 갖는 808 nm의 레이저 하에서도 높은 치료 효율을 보였다. 이는 피부에 허용된 0.329 W/cm2 보다 낮은 값이다. 새롭게 합성된 광열 치료 복합체는 표적 치료를 위한 일반적인 플랫폼이 될 것으로 기대한다. 또한, 유방암의 진단을 위하여 압타머로 수정된 실리카 나노입자를 합성하였다. 다양한 마커의 부재로 인하여 대부분의 유방암 검출 연구는 좁은 범위로 제한되어 있다. 유방암 세포에는 HER2 뿐만 아니라 MUC1이 과발현 된다는 사실을 기반으로 하여, HER2(+)와 MUC1(+) 유방암 세포를 동시에 검출할 수 있는 염료가 첨가된 이중 압타머-실리카 나노입자를 디자인하였다. 새롭게 합성된 입자를 활용하여 TEM, DLS, 표면 전하 측정, UV-Vis와 형광 스펙트럼 측정 등을 수행하였다. 염료가 첨가된 실리카 나노입자는 균일한 사이즈, 음의 표면전하, 그리고 강한 형광 신호를 보여주었다. 개발된 입자를 활용하여 높은 선택성과 민감도를 가지고 HER2(+)와 MUC1(+) 유방암 세포를 검출할 수 있었다. 마지막으로, DNA 가닥 교환 과정 검출을 위한 DNA 기반 효소-금 나노입자 복합체를 개발하였다. 본 연구에는 상동재조합에 핵심 단백질인 TmRecA와 DNA 기반 효소를 활용하였다. 색변화 검출법을 활용하기 위해, 상보적 DNA가 표지된 금나노 입자들을 이용하여 금나노 입자들을 뭉치게 하였다. 뭉친 금나노 입자들은 TmRecA와 DNA 기반 효소가 첨가되자 비가역적으로 분리가 되었고, 용액의 색은 보라색에서 붉은 색으로 변화하였다. 이 과정을 형광검출법으로도 검증하기 위하여 형광이 표지된 DNA와 소광체가 표지된 상보적 DNA를 이용하였다. 형광의 세기 변화를 기반으로 하여 성공적인 DNA 가닥 교환 과정이 검출되었다. 뿐만 아니라 DNA가 고정화된 금전극의 임피던스 변화를 기반으로 하여 DNA 가닥 교환 과정을 검출하였다. 금전극 위에 고정된 상보적 DNA가 TmRecA와 DNA 기반 효소로 인해 비가역적으로 분리되고, 임피던스가 변화하였다. 세가지 과정을 통해 성공적인 DNA 가닥 교환 과정을 검출할 수 있었다. 이와 같은 검출법은 재조합 과정의 관찰, 새로운 DNA 기반 효소의 발견, DNA 기반 효소의 검출, 그리고 다른 단백질의 활성 측정 등에 응용될 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구에서는 나노입자와 생분자 간의 접목을 통하여 전립선암의 치료법, 유방암의 진단법 및 재조합 과정의 검출법 등을 개발하였다. 본 연구에서 사용된 금나노입자나 실리카 나노입자 뿐만 아니라 다양한 나노물질들이 질병의 진단 및 치료에 응용되고 있다. 이와 같이 생분자-나노입자 복합체는 특정 질병의 진단 및 치료에 있어서 훌륭한 플랫폼로 주목받고 있으며, 앞으로도 지속적인 발전을 통하여 의학계에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.